稳转细胞株构建服务详解

将外源基因导入细胞，并使其在细胞中表达的方式可分为两大类：

瞬时表达

瞬时表达（transient gene expression，TGE），即外源DNA/RNA不会整合到宿主染色体中，虽可达到高水平表达，但通常只持续几天，一般会在96h内失效；

稳定表达

稳定表达（Stable gene expression，SGE），即外源DNA会整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。

◈ 与瞬时转染不同，稳定细胞株构建是指外源基因进入受体细胞并整合到细胞的染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。稳定细胞株有诸多用途，如蛋白抗体生产，信号传导、药物靶点研究，免疫治疗药物开发等，其表达的蛋白/抗体稳定性更好和批次差异性更小。

稳定表达细胞株主要应用于以下研究中

● 需要长期在目的细胞中研究基因功能。通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也方便长期的实验研究；

● 部分蛋白半衰期长，瞬时RNA只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，通过构建稳定株可以实验更好的基因干扰效果；

● 瞬转会引入不可预期的拷贝数表达（往往瞬时表达较高），导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选到拷贝数适量的细胞进行实验研究；

● 稳转株可以用于诱导表达系统的实验，用于控制基因的时空表达；

● 需要用目的细胞构建动物模型的实验，往往需要构建成稳定株。

-实验流程-

图1 实验流程

-慢病毒及慢病毒载体-

慢病毒（Lentivirus，LV）属反转录病毒科（Retrovirus），是球形包膜病毒，直径约80-120nm，含两个拷贝的单链RNA基因组。基因组包含在由结构和酶促蛋白核衣壳（NC）、衣壳（CA）、逆转录酶（RT）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）组成的核心内，核心被基质（MA）蛋白的蛋白质层包围。包膜蛋白（ENV）嵌入病毒粒子脂质包膜中，它与靶细胞受体结合并介导病毒粒子进入。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

图2 慢病毒结构（Dufait et al., 2013）

慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。

大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。已成为国际上最通用的转染系统之一，广泛用于各类实验室。

图3 HIV-1基因组结构与慢病毒载体包装质粒系统

（Dufait et al., 2013）

我司采用的慢病毒载体属于“第三代”慢病毒载体，其基因组的3’LTR的增强子功能发生了缺失，从而形成了所谓的“自灭活”（Self-inactivation，SIN），即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有较好的安全性。

我司慢病毒载体系统由表达载体pLenti-gene、包装辅助载体pGag/Pol和pRev、包膜载体pVSV-G四质粒组成。可以根据实验目的采用不同的表达载体pLenti-gene，如基因表达研究采用pLV-Gene、RNA干扰采用pLV-U6等进行研究。pGag/Pol载体中含有HIV病毒的gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；pRev载体编码rev基因，是调节gag和pol基因表达的调节因子。pVSV-G载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

-稳转细胞株-

构建稳转细胞株的基本原理就是将外源DNA克隆到具有某种抗性（常见嘌呤霉素（Puromycin，Puro）、新霉素（Neomycin，Neo）或G418）的载体上，再将载体通过不同的转染方式转染宿主细胞，使其整合到宿主染色体中，最后采用载体抗性进行筛选，得到可稳定过表达或沉默或敲除或编辑特定基因的细胞株。经标准药筛后，我司可提供多克隆细胞群或单克隆细胞株。