技术服务基因编辑
Gene editing
基因编辑
CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种应对病毒(如噬菌体)入侵的免疫系统,其结构包括:规律成簇的间隔短回文重复序列CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),前导序列Leader,Cas基因序列Cas gene,以及反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA) 序列。该系统主要分为 Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type Ⅲ 3种不同类型,其中Type Ⅱ系统只有一种核酸酶参与,即Cas9。CRISPR-Cas9在细菌中起到的作用就是识别入侵的病毒,将其基因组片段录入自己的基因组,当病毒再次入侵时候,切割其DNA或RNA进而消除感染。

CRISPR-Cas9系统在编辑基因的时候,需要2个组成部分:Cas9核酸酶和sgRNA(single guide RNA,引导RNA)。Cas9和sgRNA会形成一个Cas9核糖核蛋(ribonucleoprotein,RNP)。这个RNP能结合到基因组的靶序列上。基因组的靶序列如果要被切割,需要满足两个条件:第一,sgRNA与基因组上有17-21个碱基的同源区,也被称为前间隔序列protospacer。第二,靶序列附近有前间隔序列邻近基序PAM(protospacer adjacent motif),需要注意的是,在设计sgRNA时,PAM并不是sgRNA的一部分。在满足上述两个条件后,在tracrRNA引导下,sgRNA与基因组的靶序列结合,进而RNP在PAM上游4到5个碱基的位置切割靶序列,形成一个DNA双链损伤(DSB)。
 
在经过CRISPR-Cas9系统切割并产生DNA双链损伤后,哺乳动物细胞会启动两种常见的DNA修复机制对断裂进行修复,即非同源末端连接机制NHEJ和同源定向修复机制HDR。利用NHEJ机制的易错性和HDR的同源重组特性,从而实现对靶基因的敲除、敲入、定点突变以及定点修复等目的。
 
CRISPR-Cas9基因编辑技术现已风靡全球,没有哪种技术的普及与进展速度能与其比肩。2020年诺贝尔化学奖授予了法国女科学家埃玛纽埃勒·沙尔庞捷和美国女科学家珍妮弗·杜德纳,以表彰她们在基因组编辑方法研究领域做出的贡献。CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用包括但不限于:
1、用于基因敲除(沉默)或敲入(点突变、标签等);
2、通过单碱基突变等用于基因修复(如白内障);
3、阻止靶基因mRNA转录以进行基因表达调控;
4、适合构建抗性基因文库,进行大规模文库筛选;
5、在活细胞中监测染色体的构象变化或基因分布等。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的优缺点
现在国内外高校科研机构及商业市场对CRISPR-Cas9基因编辑技术的开发、改进和应用仍处在上升期,该技术本身虽已相对成熟并在生物医药领域突显了优势,但仍然有其亟待解决的缺陷。CRISPR-Cas9基因编辑技术的优缺点主要体现在方面:
 
首先,因为只需要通过设计短片段的sgRNA,即可对大多数区域的基因进行编辑,所以该技术具有成本低、使用方便、构建简单的优点。
但因为质粒较大,导致转染仍具有一定难度,且碱基识别具有偏好性,限制了其应用范围,同时也导致不同基因位点编辑效率不同,仍需要耗费大量时间进行筛选。

虽然已经对体系进行了优化,但该技术仍具有较高的脱靶率,会降低编辑效率和导致设想外的其他基因改变,影响实验结果。

虽然有上述的缺点,但还是无法阻碍CRISPR-Cas9基因编辑技术成为当下发展最快,且应用最广的基因编辑技术。

 
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