技术服务稳定细胞株构建
Stable cell lines establishment
稳定细胞株构建
慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生RNAi干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂。另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色。大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等,又很少引发机体免疫反应,能达到良好的基因治疗效果,具有广阔的应用前景。已成为国际上最通用的转染系统之一,广泛用于各类实验室。

我司采用的慢病毒载体属于“第三代”慢病毒载体,其基因组的3’LTR的增强子功能发生了缺失,从而形成了所谓的“自灭活”(Self-inactivation,SIN),即该病毒基因组整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒,也降低了对周围基因的意外激活,因此具有较好的安全性。

我司慢病毒载体系统由表达载体pLenti-gene、包装辅助载体pGag/Pol和pRev、包膜载体pVSV-G四质粒组成。可以根据实验目的采用不同的表达载体pLenti-gene,如基因表达研究采用pLV-Gene、RNA 干扰采用pLV-U6等进行研究。pGag/Pol载体中含有HIV 病毒的gag 基因,编码病毒主要的结构蛋白;pol 基因,编码病毒特异性的酶;pRev 载体编码rev 基因,是调节gag 和pol 基因表达的调节因子。pVSV-G载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G 基因,提供病毒包装所需要的包膜蛋白。
稳定细胞株构建
服务流程:
  • 含目的的基因载体
    质粒构建与纯化
  • 转染293T细胞
    包装病毒
  • 收获病毒与浓缩
    分装后-80℃保存
  • 病毒滴度测定
  • 最佳MOI测定
    感染目的细胞
  • 药物筛选
    目的基因检测

1、含目的基因的载体质粒pLV-gene的构建和纯化提取;
2、pLV-gene、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞包装病毒;
3、培养48~72h,收集培养含病毒上清;
4、慢病毒载体的纯化和浓缩(超离和/或超滤);
5、分装、-80℃保存;
6、滴度测定、目的基因检测;
7、感染目的细胞;稳定细胞株构建。
020-89449936
  • info@cellcook.com
  • 广东省广州市国际生物岛标准 产业单元一期办公区一栋102
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