Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基糖苷类抗生素,中文名为嘌呤霉素,常用于筛选能够表达pac基因的细胞。pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果表达该基因,就会对嘌呤霉素产生抗性。这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前,很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为 puror),可以利用嘌呤霉素的筛选,得到特定基因稳定表达的细胞株。
Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。
嘌呤霉素是真核和原核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂,其作用机制图如下。嘌呤霉素通过模拟氨酰化tRNA(aa-tRNA) 的3'末端,代替正常氨基酸参与翻译延长过程。它通过核糖体肽基转移酶中心(PTC)催化掺入新生链的C末端,阻止进一步延伸,导致翻译过早的终止,从而抑制了蛋白质合成,造成细胞死亡。
推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/mL,但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。
将Puromycin按所需工作浓度添加到培养基中,用于待筛选细胞的培养;
逐步筛选:pac基因转染48h后,用含有终浓度为2μg/mL的Puromycin的培养基换液;
传代时,逐步增加Puromycin的浓度,筛选稳定转导的细胞株。推荐按照2/4/6/8/10的梯度逐渐增加Puromycin用量;
筛选过程中,建议不要使用细胞做实验,抗生素会影响部分实验结果。
定期筛选:连续培养的细胞筛选频率为1-2个月,筛选时,将嘌呤霉素直接添加到培养基中,细胞正常培养传代即可,每次筛选时间为一周,嘌呤霉素终浓度为4μg/mL;
长期冻存的细胞,复苏后第二代待细胞状态稳定时,可进行筛选,维持阳性细胞比例。
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