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细胞培养中容易忽视的几个致命细节
发布日期:2023.05.12

 

细胞培养过程中很容易稍有不慎细胞状态就会变差,这些小细节究竟如何影响的细胞状态?在培养时我们又该如何避免?今天给大家整理了细胞培养过程中最容易忽视的几大致命细节,一起来学习吧!

 

 

01
 
养瓶/皿的选择和处理

 

 

 

市面上常见的有经TC处理的细胞培养瓶/皿,可以辅助贴壁细胞贴壁;培养悬浮细胞时应采用无TC处理的细胞培养瓶/皿。

 
 

贴壁细胞在正常情况下都会贴壁,但某些细胞本身特性贴壁性差,例如Beas-2B人正常支气管上皮细胞和HCEC-B4G12人角膜内皮细胞,在培养特殊细胞时,需要对培养瓶/皿进行包被,促进细胞黏附,才可以使用。常用的包被液有纤连蛋白、I型胶原等混合物,培养时可根据说明书使用。

新手建议使用细胞培养瓶培养,方便操作。

 

 

02
 
细胞传代汇合度

 

 

无论什么细胞,汇合度80%~90%左右即需要传代,不可长满。正常细胞(二倍体)存在贴壁接触抑制,长满后细胞生长停止,而肿瘤细胞等非正常细胞,接触抑制作用较弱,可生长至较高的细胞密度,但某些细胞一旦长过,其损伤难以逆转,所以培养细胞时不建议细胞密度太高。

 
 

某些特殊的细胞汇合度达到100%会开始分化,例如C2C12小鼠成肌细胞,分化的细胞没有增殖能力,影响后续实验,耽误实验进展,需要严格控制细胞传代密度。

 
 

对于一些聚团叠加生长的细胞,需根据实际细胞量判断是否需要传代,并不单纯依据细胞铺满瓶底的汇合度,及时传代,避开细胞损伤,且这类细胞的消化时间一般较久,需要根据具体的细胞量适当调整消化时间。例如HepG2人肝癌细胞、MCF7人乳腺腺癌细胞、Caco-2人结直肠腺癌细胞等。

 

 

 

03
 
细胞消化时间的选择

 

 

胰蛋白酶通常使用0.25%,含EDTA,不含钙镁离子。钙镁离子会与EDTA螯合,影响消化效果。所以加胰酶消化前需要用不含钙镁离子的PBS缓冲液润洗2~3次。

 
 

细胞消化时间可以参考说明书,但具体的消化时间需要结合细胞量、胰酶浓度等适当调整。调整。

 
 

大多数细胞的消化时间在2-3分钟左右,部分贴壁性较差的细胞消化时间较短,部分贴壁牢固且聚团叠加生长的细胞消化时间较长,最长的有30分钟,具体的细胞时间参考说明书,并结合实际细胞量调整。

 
 

消化程度判断:显微镜下细胞皱缩变圆,分散成单细胞,倾斜培养瓶可呈流沙状脱落即可终止消化。一些聚团叠加生长的细胞在消化过程中可能不会完全分散成单细胞,皱缩变圆,分解成小细胞团,轻轻吹散再消化1分钟左右即可终止消化。

 

 

04
 
培养箱气相组成

 

 

大部分培养基适合于95%空气 5%CO2的培养箱。但L15培养基适合于100%空气,无CO2的培养箱,L15培养基不需要CO2平衡PH,CO2会导致培养液PH降低(培养液变黄),严重影响细胞生长;所以使用L15培养基培养细胞,但没有100%空气培养箱时,可以选择密封的细胞培养瓶/皿培养。

 

 

05
 
培养温度

 

 

对于大部分人源细胞和温血动物细胞系来讲,比较适宜的培养温度是37℃。但有细胞比较特殊,需要用特定的温度培养,比如hFOB1.19 SV40转染人成骨细胞细胞的培养温度为34℃,37℃培养会死亡。

 

 

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