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细胞学堂|细胞冻存与复苏的那些事~~
发布日期:2022.08.22

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
细胞的冻存
检查细胞

为了避免污染造成的损失,最小化连续细胞系的遗传改变,以及避免有限细胞系的老化和转化,需要冻存哺乳动物细胞。冻存细胞前,细胞应该特性化并检查是否污染。冻存细胞应做好标记和归档,以便后续使用。

 

 

悬浮细胞
 

①计数将要冻存的活细胞。细胞应处于对数生长期。

②1200rpm,离心5min沉淀细胞,使用移液管去除上清。

③以5×106~1×107cell/mL密度,在冻存液中再次重悬细胞。

分装进冻存管,将冻存管置于4℃冰箱中15~30分钟。

将冻存管放入程序冻存盒中,-80℃冰箱过夜后,转移到液氮中贮存

 

贴壁细胞
 

①按照传代操作消化细胞,获得细胞悬液并计数。

②800~1000rpm,离心5min沉淀细胞,使用移液管去除上清。

③以1×106~5×106cell/mL的密度,在冻存液中重悬细胞。

将细胞分装进冻存管,将冻存管置于4℃冰箱中15~30分钟。

将冻存管放入程序冻存盒中,-80℃冰箱过夜后,转移到液氮中贮存。

 

#注意
 
 
01

按照ATCC提供的细胞冻存液配方,在冻存前配制即可。

02

冻存的细胞应做好标记,并记录贮存位置,方便后续查找并使用

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
细胞的复苏
 

冻存细胞比较脆弱,需要轻柔操作。冻存细胞要快速融化,并且直接添加到完全培养基中,离心后去除冻存液培养,避免DMSO或其他成分对细胞生长造成影响。

 

直接铺板方法
 

①取出贮存的细胞,37℃水浴锅中快速融化。

②直接用完全培养基铺板细胞。细胞培养至12~24小时,更换新鲜的完全培养基,去除冻存剂。(某些细胞,如间充质干细胞,复苏后为避免细胞损伤不能离心,采取直接铺板法。)

 

离心法
 

①取出贮存的细胞,37℃水浴锅中快速融化。

②把1mL冻存细胞转移至9mL完全培养基中,1000rpm,离心5min收集细胞。

③去除含有冻存液的上清

用完全培养基重悬细胞,接种到培养皿中。

 

 

#注意
 
 
01

冻存及复苏流程应按照“慢冻速融”原则。

02

操作过程严格保证无菌:融化细胞时水面不能没过管口;将细胞拿进超净工作台时,用酒精喷雾或酒精棉消毒冻存管表面。

03

完全培养基应提前恢复至室温,并分装备用。

04

24h后:对于贴壁细胞,确定是否贴壁,并估算存活率;对于悬浮细胞,检查外形(胞质透明度,颗粒度)。

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
冻存液

 

即用型细胞冻存液
 
01
 
 

冻存液的特性:常用的冻存液是DMSO(二甲基亚砜)。可防止在低温(零度以下至-196℃)保存细胞时细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。但是DMSO对细胞有毒性,细胞复苏后要快速去除。

细胞株对应的最适冻存配方需参考说明书、ATCC或文献。

 
 
02
03
 
 

部分无血清培养的细胞,冻存液也要用无血清的,例如BEAS-2B。

部分细胞使用商品化的无血清冻存液后,复苏存活率较低,推荐测试后再使用。

 
 
04

 

 

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