在肿瘤免疫治疗和传染病防治的前沿阵地，有一类细胞正扮演着"杀手"与"守护者"的双重角色——它就是CD8⁺ T细胞。作为适应性免疫系统的精锐部队，CD8⁺ T细胞能够精准识别，特异性杀伤并清除被病原体感染的细胞或肿瘤细胞。
CD8⁺ T细胞，又称细胞毒性T淋巴细胞（CTL，Cytotoxic T Lymphocyte），因表面表达CD8分子而得名。它们通过T细胞受体（TCR）识别靶细胞表面的MHC I类分子-抗原肽复合物，释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒性蛋白，并分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，诱导靶细胞凋亡与裂解。
图一：静息状态下的CD8⁺ T细胞
图二：流式检测CD8⁺ T细胞表面标志物CD8蛋白表达情况
如何获得CD8⁺ T细胞
●外周血单个核细胞（PBMC）：最常用来源，通过密度梯度离心分离获得
●肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）：直接从肿瘤组织中分离，肿瘤特异性更强
●脐带血或干细胞分化：用于特定研究或通用型细胞产品
若需获得高纯度CD8⁺ T细胞，可采用：
●磁珠分选（MACS）：用CD8磁珠阳性分选，纯度可达95%以上
●流式分选（FACS）：精度更高，可同时分选特定亚群（如naïve、效应、记忆T细胞）
如何培养、激活CD8⁺ T细胞
⚠：以下实验条件为实验科研用法，非临床应用
✅培养条件
37℃、5% CO₂，密度控制在0.5–2×10⁶ cells/mL，定期补液或换液
✅培养基
基础完全培养基：RPMI 1640为主，添加10%热灭活的胎牛血清（FBS）
激活完全培养基：RPMI 1640+10%热灭活FBS+50U/mL IL-2
激活后培养完全培养基：RPMI 1640+10%热灭活FBS+50U/mL IL-2+50μM β-巯基乙醇+2mM L-谷氨酰胺（可选添加10ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15）
热灭活胎牛血清制备：胎牛血清56°C水浴加热30分钟。热灭活完成后如血清中出现沉淀，可2000rpm离心10min后取上清混匀再使用。（或使用商品化热灭活胎牛血清。）
为什么要用热灭活胎牛血清？
胎牛血清（FBS）中含有补体蛋白（如C1、C3、C4等），这是天然免疫系统的重要组成部分。补体系统被激活后，会在靶细胞膜上打孔，导致细胞裂解死亡。
培养基中各添加因子功能：
● IL-2：T 细胞经典生长因子，强力驱动 CD8⁺ T 细胞增殖与扩增
● β-巯基乙醇：还原剂，维持细胞内还原环境，清除活性氧，促进 T 细胞生长与存活。（β-巯基乙醇有刺激性气味和毒性，母液需在通风橱中配制，避免直接接触皮肤）
● L-谷氨酰胺：作为能量代谢底物和氨基酸前体，支持活化的 CD8⁺ T 细胞高速增殖、蛋白质合成及三羧酸循环
●IL-7：支持 naïve T 细胞存活与增殖，通过 STAT5 信号维持 T 细胞增殖潜能；与 IL-15 联用有助于保留干细胞样记忆T细胞（Tscm）表型
● IL-15：强效促进记忆性 CD8⁺ T 细胞增殖，对 naïve CD8⁺ T 细胞也有显著扩增作用
✅CD8⁺ T细胞激活培养步骤
（以已分离纯化好的CD8⁺ T细胞冻存株为例）
复苏流程与普通细胞复苏基本一致，注意以下三点操作细节即可：①复苏前预热培养基②离心：1500rpm离心3-5min（CD8⁺ T细胞颗粒较小，复苏时提高离心转速，避免细胞丢失）③复苏后24h待细胞状态稳定可进行激活操作
可使用CD3/CD28磁珠试剂盒或CD3和CD28抗体激活CD8⁺ T细胞，激活24-48h即可，勿超过72h，避免细胞过度激活，易出现耗竭与死亡。（具体激活时间可参照所用磁珠试剂盒说明书，不同品牌可能存在差异）。
培养过程中要避免过度激活导致的T细胞耗竭（exhaustion），表现为PD-1、TIM-3等抑制性受体高表达，杀伤功能下降。
图三：CD8+ T细胞磁珠法激活原理示意图
以CD8⁺ T细胞CD3/CD28磁珠试剂盒激活为例：
CD8⁺ T细胞复苏24h后，1500rpm，3min离心收取细胞团并用37℃预热的PBS清洗一遍
计数取2×10^6个CD8⁺ T细胞于15ml离心管中，加入3ml预热的“激活完全培养基”轻柔重悬细胞团
取4×10^6个CD3/CD28磁珠（磁珠与细胞比例为2：1，也可按1:1添加磁珠，但CD8⁺ T细胞容易激活不足），用1×PBS重悬清洗一遍，磁力架吸附磁珠后弃去PBS。
用02中“激活完全培养基”重悬转移磁珠，与CD8⁺ T细胞轻柔混匀后接种至6孔板（1孔）
将6孔板置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中激活培养24-48h。
激活完成后离心收集细胞团（此时可收取激活上清进行ELISA检测关键分子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等表达水平），用37℃预热的PBS重悬，磁力架吸附磁珠，转移细胞悬液至新的15ml离心管再次离心。
弃上清，加入3ml预热的“激活后培养完全培养基”轻柔重悬细胞团，并取样进行细胞计数。
（注意：激活后由于磁珠吸附、离心损失、激活损伤等原因，细胞回收率在50%-70%，属正常现象。如回收率低于50%，建议检查磁珠比例是否过高或激活时间是否过长。）
激活后的CD8⁺ T细胞置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养，每隔3天左右补液或换液，传代时计数，密度控制在0.5–2×10⁶ cells/mL。
CD8⁺ T细胞激活后培养要点：
●培养过程中用到的培养基与PBS均需预热。
●CD8+ T细胞激活后最佳使用时间为激活后5-7天，使用前建议检测关键因子表达水平（如PD-1、GZMB、PFN、IFN-γ等）。
●培养密度维持在0.5-2×10^6个/ml，pH下降、培养液变黄时需要及时换液。
●传代吹散要轻柔，不需要全部吹散，传代时维持细胞小聚团状态，细胞增殖状态会更好。
CD8⁺ T细胞CD3/CD28磁珠试剂盒激活过程（示例）：
CD8⁺ T细胞CD3/CD28磁珠试剂盒激活过程中细胞形态变化描述：
●未激活时细胞单个悬浮，直径较小（约6–8 µm）；激活后大部分聚团悬浮，直径变大（约10–15 µm）。
●激活时，激活初期（0-12h）细胞向磁珠汇集，形态逐步从圆形伸长为杆状，细胞黏附磁珠聚团悬浮。
●细胞激活后聚团细胞随增殖传代后逐步分散，增殖速度渐慢，增殖后期细胞从圆形逐步长出触角，形态变得不规则。
CD8⁺ T细胞培养过程形态变化（示例）：
CD8⁺ T细胞激活后关键分子表达水平变化：
CD8⁺ T细胞用途
●TIL疗法：从患者肿瘤中分离TIL，体外扩增后回输，在黑色素瘤中已展现持久疗效
●TCR-T细胞治疗：靶向肿瘤特异性抗原（如NY-ESO-1），在实体瘤中崭露头角
●CAR-T产品的核心杀伤主力：虽然CAR-T多用CD8⁺/CD4⁺混合，但CD8⁺亚群的细胞毒效应是杀伤主力
●抗病毒治疗：针对HIV、CMV、EBV等慢性感染，输注体外扩增的病毒特异性CD8⁺ T细胞可重建免疫防御
●疫苗研发：评估疫苗诱导CD8⁺ T细胞应答的强度，是判断细胞免疫疫苗效力的金标准
●免疫检查点机制研究：探究PD-1/PD-L1通路如何抑制CD8⁺ T细胞功能
●肿瘤微环境解析：通过单细胞测序分析肿瘤内CD8⁺ T细胞的耗竭、衰老和克隆扩增状态
●联合用药筛选：在体外评估药物对T细胞功能的增强或抑制作用
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