产品包装

保存条件

4^oC避光保存一年有效，-20^oC避光保存两年有效。反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，如需经常使用请将试剂存放在4^oC。

产品概述

Cell Counting Kit-8 简称CCK-8试剂盒，是MTT的升级替代方法，是一种基于 WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度且无放射性的检测试剂盒。

检测原理：WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）(参考图1)。产生的formazan的量与活细胞的数量成正比。因此，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。使用酶标仪在450nm 波长处测定OD 值，间接反映活细胞数量。

CCK-8法与MTT、MTS等细胞增殖或毒性检测方法相比具有明显的优势。首先，由于 WST-8产生的formazan 是水溶性的，因此不再需要DMSO等有机溶剂来溶解。其次，WST-8比MTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8检测灵敏度更高，更易溶解。

本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制，可以直接加入到细胞样品中，检测快速，可以用于大批量样品的检测。本试剂盒可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及一些生物活性因子的活性检测等。

CCK-8试剂的细胞毒性非常低，加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。

使用方法

1、细胞接种到96孔板中

收集对数期细胞，先用细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数，通常细胞增殖实验每孔加入100μl 2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl 5000个细胞。（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定，初次实验时可以先要设置5-7个细胞浓度梯度，制作一条以细胞数为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线，便于确定细胞的接种数量。）

2、 37℃、5% CO₂的培养箱中培养

将细胞在培养箱中培养24小时，或培养至细胞贴壁，也可以根据实验要求，培养相应的时间。

3、加入待测药物

进行细胞增殖和细胞毒性测定时，按照实验需要，向每孔中加入待测药物，将培养板在培养箱中培养适当的时间。

▲若进行细胞活性检测，则不需要此步骤。

4、每孔加入10μl CCK-8溶液。

如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μl CCK-8溶液（加入的CCK-8溶液为每孔培养基总体积的10%）。可以用加了等体积细胞培养基和CCK-8溶液但没有加细胞的孔作为空白对照。

5、37℃、5% CO₂的培养箱中孵育

在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时，大多数情况孵育1小时即可。孵育时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6、酶标仪在450nm处测定吸光度。

注意事项

Ø   第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的孵育时间。

Ø   如果细胞培养时间较长，需要注意蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养基。

Ø   接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致加入到每孔中的细胞数量不一致。可以采用多通道移液器，减少平行孔间的误差。

Ø   为了避免加样时由于CCK-8残留在枪头上或孔壁上所带来的误差，可以在加样前用培养基稀释CCK-8 试剂并混匀后加样。加CCK-8 试剂时注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。

Ø   培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Ø   CCK-8法的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。为减少药物对测定的可能影响，可以在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

Ø   CCK-8的毒性非常低，细胞在CCK-8 法检测后仍然可以正常生长，可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非细胞极为稀少，否则不推荐再用于其他实验。

Ø   如果OD值太低,可以适当增加细胞数量或者延长加入CCK-8试剂后的孵育时间。

Ø   本产品仅限于专业人员的科学研究使用