目录号 CT01
英文名字 CCK-8 Detection Kit
保存温度 -20℃
效期 24monthes
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产品参数
目录号
CT01
英文名字
CCK-8 Detection Kit
保存温度
-20℃
效期
24monthes
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产品详情

产品包装

目录号

产品名称

规格

包装

CT01T

Cell   Counting Kit-8

50T

0.5mL

CT01A

Cell   Counting Kit-8

500T

5mL

CT01B

Cell   Counting Kit-8

1000T

5mL×2

CT01C

Cell   Counting Kit-8

3000T

5mL×6


说明书

1

1

保存条件

4oC避光保存一年有效,-20oC避光保存两年有效。反复冻融会增加背景值,干扰实验测定,如需经常使用请将试剂存放在4oC

产品概述

Cell Counting Kit-8 简称CCK-8试剂盒,是MTT的升级替代方法,是一种基于 WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度且无放射性的检测试剂盒。

检测原理:WST-8在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan(参考图1)。产生的formazan的量与活细胞的数量成正比。因此,细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。使用酶标仪在450nm 波长处测定OD 值,间接反映活细胞数量。

CCK8.png

CCK-8法与MTTMTS等细胞增殖或毒性检测方法相比具有明显的优势。首先,由于 WST-8产生的formazan 是水溶性的,因此不再需要DMSO等有机溶剂来溶解。其次,WST-8MTTMTS更加稳定,使实验结果更加稳定。另外,WST-8检测灵敏度更高,更易溶解。

本试剂盒检测非常便捷。试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8CCK-8溶液,无须再进行任何配制,可以直接加入到细胞样品中,检测快速,可以用于大批量样品的检测。本试剂盒可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及一些生物活性因子的活性检测等。

CCK-8试剂的细胞毒性非常低,加入WST-8显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。

使用方法

1、细胞接种到96孔板中

收集对数期细胞,先用细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数,通常细胞增殖实验每孔加入100μl 2000个细胞,细胞毒性实验每孔加入100μl 5000个细胞。(具体每孔所用的细胞的数目,需根据细胞的大小、细胞增殖速度的快慢等因素决定,初次实验时可以先要设置5-7个细胞浓度梯度,制作一条以细胞数为横坐标(X 轴),OD 值为纵坐标(Y 轴)的标准曲线,便于确定细胞的接种数量。)

2 37℃5% CO2的培养箱中培养

将细胞在培养箱中培养24小时,或培养至细胞贴壁,也可以根据实验要求,培养相应的时间。

3、加入待测药物

进行细胞增殖和细胞毒性测定时,按照实验需要,向每孔中加入待测药物,将培养板在培养箱中培养适当的时间。

▲若进行细胞活性检测,则不需要此步骤。

4、每孔加入10μl CCK-8溶液。

如果起始的培养体积为200μl,则需加入20μl CCK-8溶液(加入的CCK-8溶液为每孔培养基总体积的10%)。可以用加了等体积细胞培养基和CCK-8溶液但没有加细胞的孔作为空白对照。

537℃、5% CO2的培养箱中孵育

在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时,大多数情况孵育1小时即可。孵育时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5124小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6、酶标仪在450nm处测定吸光度。

注意事项

Ø   第一次做实验时,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的孵育时间。

Ø   如果细胞培养时间较长,需要注意蒸发问题。由于96孔板周围一圈最容易蒸发,可以采取弃用周围一圈的办法,改加相同量的PBS、水或培养基。

Ø   接种时注意细胞悬液一定要混匀,以避免细胞沉淀下来,导致加入到每孔中的细胞数量不一致。可以采用多通道移液器,减少平行孔间的误差。

Ø   为了避免加样时由于CCK-8残留在枪头上或孔壁上所带来的误差,可以在加样前用培养基稀释CCK-8 试剂并混匀后加样。加CCK-8 试剂时注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数。

Ø   培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

Ø   CCK-8法的检测依赖于脱氢酶催化的反应,所以还原剂会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。为减少药物对测定的可能影响,可以在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。

Ø   CCK-8的毒性非常低,细胞在CCK-8 法检测后仍然可以正常生长,可用于其他细胞增殖测定,例如结晶紫测定,中性红测定或DNA荧光测定。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响,除非细胞极为稀少,否则不推荐再用于其他实验。

Ø   如果OD值太低,可以适当增加细胞数量或者延长加入CCK-8试剂后的孵育时间。

Ø   本产品仅限于专业人员的科学研究使用



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